Você assume o papel de Ezio Auditore Di Firenzi, um nobre, agora assassino, que busca vingança pela morte de sua família. Ambientado em 1476 na Itália, 285 anos depois do primeiro Assassin's Creed, esta segunda edição trará novos tipos de missões em Veneza, Florença e Roma, onde Ezio Di Firenzi adquirirá a habilidade necessária para se tornar um assassino. Além de esquivar-se silenciosamente sobre os telhados fugindo de guardas, escalar paredes e usar técnicas mortais de luta, ele encontrará personagens famosos da história italiana, inclusive Leonardo Da Vinci, que poderá lhe fornecer novas armas e instrumentos. Mas, o que no início era uma vingança pessoal, levará Ezio ao centro de uma conspiração que jamais poderia ser imaginada.